La minociclina 118

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La minociclina y Tejidos Tipo-activador del plasminógeno de Evaluación de Carrera de interacción potencial Livia S. Machado. PhD Irina Y. Sazonova. PhD Anna Kozak. MS Daniel C. Wiley. BS Azza B. El-Remessy. PhD, RPh Adviye Ergul. MD, PhD David C. Hess. MD Jennifer L. Waller. PhD Susan C. Fagan. Farmacia del programa en la Clínica y Terapéutica Experimental, Departamento de Clínica y Administrativa Farmacia (LSMAKDCWABEAEDCHSCF), Facultad de Farmacia, Universidad de Georgia Charlie Norwood Veterans Affairs Medical Center (LSMAKDCWABESCF) y los Departamentos de Medicina (AIS), Neurología (DCHSCF), fisiología (AE), y Bioestadística (JLW), Colegio Médico de Georgia, Augusta, Georgia. Correspondencia a Susan C. Fagan, Farmacia, Universidad de Georgia, Facultad de Farmacia, HM-1200, 1120 15th St, Augusta, GA 30912-2450 . sfaganmail. mcg. edu E-mail Resumen Antecedentes y estrategias de tratamiento nuevo propósito para el accidente cerebrovascular isquémico agudo deben ser evaluadas en el contexto de la reperfusión eficaz. Minocycline es un agente neuroprotector que inhibe las enzimas proteolíticas y por lo tanto potencialmente podrían inactivar tanto el efecto de lisis de coágulos y disminuir los efectos perjudiciales de tipo activador del plasminógeno tisular (t-PA). Este estudio tuvo como objetivo determinar el efecto de la minociclina en el t-PA lisis del coágulo y la formación de la hemorragia t-PAinduced después de la isquemia. Métodos fibrinolítica y actividades amidolíticas de t-PA se investigaron in vitro en un rango de concentraciones de minociclina clínicamente relevantes. Se utilizó un modelo de oclusión de la sutura de 3 horas de isquemia cerebral temporal en ratas tratadas con t-PA y 2 regímenes diferentes de minociclina. Se evaluaron los componentes de la barrera hematoencefálica lámina basal, metaloproteinasas de la matriz (MMPs), formación de hemorragia, el tamaño del infarto, edema, y ​​los resultados de comportamiento. Resultados La minociclina no afectó t-PA fibrinólisis. Sin embargo, el tratamiento minociclina en 3 mg / kg IV disminución de la expresión de proteína total de MMP-2 (P 0,0034) y MMP-9 (P 0,001 para 92 kDa y P 0,0084 para 87 kDa). También disminuyó la incidencia de hemorragia (P 0,019), la mejora de los resultados neurológicos (P 0,0001 para marcar Bederson y P 0,0391 para la prueba de comprensión de la pata), y pareció disminuir la mortalidad. la inhibición de MMP se asoció con una disminución de la degradación en el colágeno IV y laminina-1 (P 0,0001). Conclusiones El tratamiento de combinación con minociclina es beneficioso en animales t-PAtreated y no compromete la lisis del coágulo. Estos resultados también sugieren que la protección neurovascular por minociclina después del accidente cerebrovascular puede implicar la protección directa de la barrera hematoencefálica durante la trombolisis con t-PA. Introducción La comunidad científica y los organismos reguladores exigen que todos los nuevos tratamientos agudos para el accidente cerebrovascular isquémico ser evaluados por su potencial para interactuar con el único activador del plasminógeno de la terapia, de tipo tisular aprobado (t-PA). El tratamiento intravenoso con t-PA dentro de 3 horas del inicio del accidente cerebrovascular se ha demostrado ser beneficioso para lograr mejores resultados, 1 y la información reciente sugiere que los pacientes cuidadosamente seleccionados pueden beneficiarse al ser tratados incluso hasta 4,5 horas después de la aparición de los síntomas. 2 Sin embargo, todavía hay una gran necesidad de desarrollar tratamientos que complementan y mejoran la seguridad y eficacia del t-PA. Los datos recientes han demostrado que el t-PA tiene efectos nocivos que son independientes de su actividad fibrinolítica y que el t-PA conduce a una mayor probabilidad de transformación hemorrágica mediante la amplificación de la cascada de la metaloproteinasa de matriz (MMP) provocada por el daño isquémico en el cerebro. 3 MMP-2 (72 kDa) y -9 (92 kDa) se han demostrado ser elevados temprano después del accidente cerebrovascular experimental en ratas, 46 y la formación de edema y la transformación hemorrágica asociada con la trombolisis con t-PA se han relacionado con las MMPs. por lo tanto, 79 de inhibición de MMP podría representar una diana para la disminución de los riesgos de la trombólisis. 10 tratamiento Minocycline se ha demostrado que disminuye la interrupción y las fugas de la barrera hematoencefálica 11 y atenuar la actividad enzimática de la enzima proteolítica MMP-9 después de la estimulación con el factor de crecimiento endotelial vascular. 12 Además, la minociclina se ha demostrado que disminuye la permeabilidad microvascular asociada con la MMP-2 y MMP-9 actividad. 13 Nuestros estudios previos demostraron que el tratamiento minociclina después de la lesión se redujo la activación de MMPs después de la isquemia cerebral temporal. 14 A pesar de que la minociclina es una estrategia prometedora neuroprotector, una investigación a fondo de su interacción con el t-PA después del accidente cerebrovascular no se ha perseguido. La minociclina podría reducir la actividad fibrinolítica t-PA a través de su efecto inhibidor del enzima. Sin embargo, también se podría evitar la activación de MMP inducida por reperfusión y el daño vascular. Este estudio tuvo como objetivo determinar si la interacción de la minociclina con t-PA fue significativa in vitro y en un modelo experimental de infarto. Materiales y Métodos t-PA in vitro lisis del coágulo y la actividad de t-PA actividad amidolítica se midió por fibrinolítica in vitro y ensayos amidolıticas. Para el ensayo fibrinolítico, se obtuvo sangre entera de 4 individuos sanos. Este estudio fue aprobado por el comité de evaluación humana del Colegio Médico de Georgia. La sangre entera (50 L) de individuos sanos se mezcló con cantidades traza de 125 fibrinógeno marcado con I humana (100 000 recuentos por minuto) y coagulada. Los coágulos formados se lavaron, se suspendieron en plasma (1 ml), y se colocaron en un baño de agua a 37ºC. Una amplia gama de concentraciones clínicamente relevantes de la minociclina se añadió (0 a 30 g / ml) al sobrenadante, y la lisis del coágulo se inició de inmediato por 2 nmol / L t-PA (Activase, Genentech). El grado de fibrinólisis se midió en varios momentos de la incubación contando los 125 por ciento solubles productos de degradación de la fibrina-I. 15,16 Los parámetros cinéticos de amidolisis se midieron en presencia o ausencia de minociclina con H - d - isoleucyl - l prolil - l - arginine - p dihidrocloruro nitroanilida (S-2288, cromogénico) como sustrato. Se añadió t-PA (100 nmol / L) a la placa de microtitulación que contiene el tampón de ensayo (0,1 mol / L de Tris-HCl, 0,1 mol / L de NaCl pH 8,4), la minociclina (30 g / ml), y S-2288 ( 150 a 1500 mol / L) a 37ºC. La generación de actividad amidolítica se midió a 405 nm durante 7 minutos en un lector de microplacas (Synergy HT, Bio-Tech). Los datos se representan como la velocidad de liberación de p nitroanilida sobre la concentración de sustrato y se analizaron mediante el ajuste con el software GraphPad Prism curva hiperbólica. 17 Procedimientos de animales y el accidente cerebrovascular experimental El cuidado de los animales y el uso comité institucional del Veterans Affairs Medical Center aprobó el protocolo de estudio. ratas Wistar macho que pesaban 270-300 g se adquirieron en Charles River Laboratory (Wilmington, MA). La isquemia cerebral fue inducida por la oclusión de sutura intraluminal de la arteria cerebral media durante 3 horas. 14 Inmediatamente antes de la retirada de la sutura, la vena yugular se expuso y la punta de un catéter de rata vena yugular (Braintree Scientific R-JVC) tapado con un tapón de puerto catéter (Braintree Scientific 23-PP) se insertó en el lumen. Después de retirar la sutura, el catéter yugular se conectó a polietileno de 50 tubos y se inundó con 1 ml de solución salina heparinizada, seguido por una inyección en bolo que contiene 10 de la dosis de t-PA, y una infusión de 20 minutos se inició (Harvard Apparatus Bomba de infusión). Los animales fueron asignados a 1 de 4 grupos: control (tratamiento con solución salina solamente) t-PA por sí solo (10 mg / kg) t-PA más minociclina (Sigma Aldrich Co 3 mg / kg IV, la vena yugular) y t-PA más minociclina dado por vía intraperitoneal. Minocycline 45 mg / kg IP se inyectó 5 minutos después del inicio de la reperfusión, y ambos grupos IV e IP recibió una dosis intraperitoneal 12 horas más tarde. Sacrificar, ya sea con la perfusión de solución salina (tamaño del infarto y la hemoglobina) o (marcadores moleculares) de flash-congelación del cerebro se produjo el tejido 24 horas después del accidente cerebrovascular. Gelatina Zymography y MMP inmunotransferencia Después de la extracción, el cerebro se lavó con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo y se coloca en una matriz coronal a ser cortado en lonchas y se homogeneizaron, como se describe anteriormente por Heo y colaboradores 5 y Machado et al. 14 zimografía de gelatina y MMP-2 y -9 inmunotransferencia se realizaron como se informó en nuestro estudio anterior. 14 Las bandas se cuantificaron con el uso de software de análisis de imágenes GelPro. Los componentes de la lámina basal de colágeno de tipo IV y laminina-1 Slot-Blot Analysis, laminina-1 y colágeno tipo IV, se utilizaron para determinar la salud de la barrera hematoencefálica en los animales de experimentación. Ambos IV y laminina proteínas de colágeno se estudiaron con Blot ranura y semiquantification por análisis densitométrico. Se utilizó el mismo homogeneizado de tejido cerebral se utiliza para el análisis de MMP. Se utilizaron membranas de nitrocelulosa. Las muestras se cargaron en el aparato Bio-Dot (Bio-Rad Laboratories) y se aplicó un vacío lento. anticuerpos de tipo IV colágeno (policlonal de conejo anti-colágeno IV, Santa Cruz Biotechnology) y laminina-1 (cabra policlonal anti-laminina-1, Santa Cruz de Biotecnología) se utilizaron. Los anticuerpos secundarios, IgG anti-conejo y anti-cabra de rábano picante anticuerpos IgG peroxidaseconjugated, se utilizaron, respectivamente. Las membranas se desarrollaron y se expusieron a películas de autorradiografía (Hyblot CL, Denville Scientific Inc). Semiquantification de las bandas se realizó con el uso de software de análisis de imágenes GelPro. El tamaño del infarto y la determinación Edema Los volúmenes de infarto se midieron en 2,3,5-trifeniltetrazolio rodajas de cerebro chloridestained, como se describió anteriormente. 18 La imagen de las rodajas se capturó y se analizó con software Zeiss KS300. El volumen total de infarto se informa como porcentaje en volumen del hemisferio isquémica total. El edema se cuantificó mediante el porcentaje de diferencia en volumen entre el accidente cerebrovascular y hemisferios contralaterales. Formación de la hemorragia y ELISA para la hemoglobina La presencia de hematoma o hemorrágico transformación visible se registró, y la cuantificación de la hemorragia se realizó mediante la evaluación del contenido de hemoglobina en el tejido después de la perfusión completa del cerebro. Esto se logró mediante un método de ELISA para la hemoglobina, como se ha informado previamente. 19 Examen Neurológico Todos los animales fueron examinados para la función motora inmediatamente antes de la reperfusión y antes del sacrificio. Se utilizó el método de agarre 20 y la pata de prueba Bederson. La prueba de la pata alcance utiliza una escala de 0 a 3 y determina el uso y la fuerza de agarre de la extremidad anterior ipsilateral. La ocurrencia de muerte o cercana a la muerte (imposibilidad de realizar las pruebas) también fue registrada. Análisis de datos para examinar las diferencias en diversas medidas de resultado entre los grupos de tratamiento, 2 pruebas (cuando la variable fue categórico) y ANOVA de 1 vía (cuando la variable fue continua) se realizaron. Debido a que no todas las comparaciones por pares post hoc se justificaban entre los grupos de tratamiento, se utilizó un ajuste de Bonferroni para el nivel global para el número de comparaciones post hoc. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SAS 9.1.3, y la significación estadística se evaluó a un nivel de 0,05. Se realizaron estudios de Resultados t-PA Actividad cinéticos para determinar si la minociclina puede afectar directamente la actividad proteolítica del t-PA. Los parámetros cinéticos de la escisión del sustrato tripéptido S-2288 a pH 7,4 y 37 ° C por t-PA se muestran en la Tabla 1. La minociclina (30 g / ml) no cambió ya sea la constante aparente de Michaelis-Menten (K m) o la constante catalítica (K gato). Por lo tanto, la minociclina no afecta a la eficiencia amidolítica de t-PA. Para probar la actividad fibrinolítica de t-PA, se utilizó un ensayo de lisis de coágulos in vitro. En presencia de diferentes concentraciones de minociclina (1 a 30 g / ml), la tasa de lisis de coágulos por t-PA (2 nmol / L) se mantuvo en 17, 38, y 55 después de 35, 75, y 120 minutos, respectivamente, independientemente de la concentración de minociclina (Figura 1). En ningún concentraciones ensayadas hizo minociclina disminución de la fibrinólisis por t-PA. Tabla 1. Efecto de la minociclina sobre los parámetros amidolítica de t-PA Figura 1. Efecto de la minociclina sobre la actividad fibrinolítica del t-PA. La lisis de los coágulos de sangre se inició por 2 nmol / L t-PA a 37ºC. La cantidad de la fibrinólisis se determinó midiendo la liberación de productos de degradación solubles 125-I de fibrina en diversos intervalos de tiempo (35, 75, y 120 minutos). La actividad fibrinolítica de t-PA no fue afectada por cualquier concentración de minociclina ensayada (130 g / ml). se muestran MeansSEM (n4). MMP-2 y MMP-9 Sólo 2 bandas se detectaron mediante zimografía de gelatina: 85 kDa y 67 kDa, que corresponde a activa MMP-9 y MMP-2 activa, respectivamente. tratamiento t-PA durante la reperfusión aumentó la actividad tanto de MMP-2 y MMP-9 en el cerebro. Los animales tratados con minociclina habían disminuido exacerbación t-PAinduced de la actividad de MMP en comparación con los animales no tratados, pero estas diferencias no fueron significativas (Figura 2 A). tratamiento minociclina intravenosa, sin embargo, un impacto significativo en el contenido de proteína tanto de MMP-2 (detectado en 72 kDa: F 3,88, P 0,0185) y MMP-9 (92 kDa: F 4,75, P 0,008 y 87 kDa: F 4,03, P 0,0160 bandas) (Figura 2 B). minociclina intravenosa disminuyó significativamente todas las bandas detectadas en comparación con t-PA (P 0,0034 para MMP-2, P 0,0084 para 87-kDa MMP-9, y P 0,001 para 92-kDa MMP-9) y 87-kDa MMP-9 en comparación con el control (P 0,004). Figura 2. A, Brain MMP-2 y MMP-9 actividades después del accidente cerebrovascular, medido por zimografía de gelatina. MMP-2 y MMP-9 fueron elevados por t-PA en comparación con controles de solución salina isquémicos. Minociclina (Mino) disminuyó la actividad de MMP-9 por debajo de los niveles de control (p = NS). B, el contenido de proteína del cerebro MMP-2 (72 kDa) y MMP-9 (87 y 92 kDa) 24 horas después del accidente cerebrovascular, según se determina mediante inmunotransferencia. El grupo de minociclina intravenosa tenía significativamente más bajos contenidos de MMP-2, 92-kDa MMP-9, y 87-kDa de la proteína MMP-9 en comparación con los animales t-PAtreated (P 0,0034, P 0,001, y P 0,0084, respectivamente). Las barras verticales indican SEM. Minocycline Plus t-PA y Vascular resultado Se midió la integridad vascular según 4 parámetros diferentes: (1) Incidencia de la transformación hemorrágica visible, (2) el contenido de hemoglobina en el parénquima cerebral después de la perfusión completa, (3) la formación de edema cerebral, y (4) lámina basal degradación de proteínas. Aunque el contenido de hemoglobina del tejido en los animales t-PAtreated fue sólo ligeramente mayor que en los animales no tratados (no mostrados), la aparición de hemorragia observada macroscópicamente en estos cerebros animales fue 2 veces mayor que en animales control y minocyclinetreated intravenosos (P 0,0190 Figura 3 A). La inspección de los animales que murieron prematuramente también reveló que los animales t-PAtreated habían desarrollado grandes hematomas cerebro, como se ilustra en la figura 3 B. Aunque no es significativo, edema estaba ligeramente elevada en el grupo de t-PA y se disminuyó en combinación con minociclina intravenosa (Figura 3 C). cerebros isquémicos habían reducido significativamente el colágeno tipo IV en comparación con los cerebros simulados (F 5,96, P 0,0011). tratamiento t-PA reduce aún más la cantidad de colágeno, y el tratamiento de combinación con 3 mg / kg IV minociclina conserva esta proteína por encima de la de los animales de control isquémicos (Figura 4 A P NS). Del mismo modo, la minociclina intravenosa robustamente impedido laminina-1 degradación en el cerebro (F 11,28, P 0,0001) en comparación con ambos grupos con accidente cerebrovascular (Figura 4 B). Figura 3. A, se incrementó la transformación hemorrágica (P 0,0190) en los animales tratados con 10 mg / kg t-PA. tratamiento adyuvante con minociclina (Mino 3 mg / kg IV) impidió este aumento. B, El sangrado en el cerebro de un animal del grupo t-PAtreated (10 mg / kg). Los hematomas se observaron en los animales que murieron. C, el tratamiento Minociclina (3 mg / kg IV) no disminuyó significativamente el edema. Las barras verticales indican SEM. Figura 4. A, Efecto del tratamiento en el colágeno de tipo IV contenido de proteína en el cerebro. Accidente cerebrovascular disminuyó significativamente el valor basal (p 0,0011). El tratamiento con t-PA 10 mg / kg disminuyó aún más colágeno IV. El tratamiento con 3 mg / kg IV minociclina (Mino) disminuye la degradación del colágeno. B, Efecto del tratamiento en laminina-1 contenido de proteína en el cerebro. Stroke disminuido significativamente laminina-1, y el tratamiento con 3 mg / kg minociclina fuertemente impedido la degradación de laminina (P 0,0001). Las barras verticales indican SEM. El tamaño del infarto y neurológicas Evaluación t-PA aumentaron el volumen del infarto (F 4,99, P 0,013) en comparación con animales de control isquémicas (infundidos con solución salina solamente P 0,0035). animales minocyclinetreated intravenosas habían disminuido el tamaño del infarto en comparación con los animales t-PAonly, pero se mantuvo por encima de los niveles de control y no fue estadísticamente significativa (Figura 5 A). t-PA aumento de la mortalidad, y esto se ha mejorado por la minociclina (Tabla 2). minociclina intravenosa aguda resultó en una mejoría de la puntuación Bederson (F 11.16, P figuras 6A y 6B). Aunque el tratamiento intraperitoneal con minociclina parecía disminuir el deterioro, el efecto no fue estadísticamente significativa, lo que sugiere que la administración de fármacos temprana es crítica para lograr un mejor resultado funcional óptima. Figura 5. A, El tamaño del infarto después de la corrección para el edema. t-PA aumentado significativamente el tamaño del infarto (P 0,0035). El tratamiento adyuvante con 3 mg / kg IV minociclina (Mino) se redujo el tamaño del infarto. Las barras verticales indican SEM. B, las fotografías de las secciones del cerebro representativas de cada uno de los grupos de tratamiento. Figura 6. Efecto del tratamiento sobre el resultado del comportamiento. A, la mejora en la escala Bederson de los animales tratados con minociclina intravenosa (Mino) en comparación con los animales t-PAonlytreated (P 0,0001). B, El grupo de tratamiento con minociclina t-PAintravenous obtenido mejores resultados en la tarea de la pata agarre (P 0,0391). Las barras verticales en todos los gráficos representan SEM. Discusión Este estudio demostró que el efecto de inhibición de MMP de la minociclina no afectó la capacidad de t-PA para escindir el plasminógeno y ejercer su efecto fibrinolítico. Este fue validado en vivo por Murata y colaboradores. 21 En su estudio, el tratamiento con minociclina no tuvieron un efecto significativo sobre la perfusión cerebral restaurado por t-PA después del accidente cerebrovascular embólico en ratas. Sin embargo, el efecto de lisis de coágulos de la interacción tratamiento no se ha estudiado directamente. Hemos demostrado en este estudio que el tratamiento tras la reperfusión tanto con bajas dosis de minociclina intravenosa y altas dosis de minociclina intraperitoneal inhibe las MMP que están regulados al alza mediante el tratamiento con t-PA. Estos 2 regímenes de dosificación de la droga se basaron en estudios previos que demostraron la eficacia terapéutica de la minociclina en el accidente cerebrovascular experimental. 18,22 La administración intraperitoneal se ha demostrado para lograr una concentración de plasma retrasado pero constante. 23 Sin embargo, debido a la liberación sistémica de la minociclina se retrasa, también a prueba si el parto aguda de la minociclina (mediante la administración intravenosa) podría alcanzar resultados mejorados o comparables. Ambos tratamientos parecían disminuir el aumento t-PAinduced en MMP-9, pero sólo el grupo tratado por vía intravenosa lograron una reducción significativa en la expresión de proteínas. Estos hallazgos apoyan nuestros resultados previos que demuestran que la isquemia inducida por MMP-2 y -9 son sensibles a la inhibición de la minociclina y 14 que la entrega anterior de minociclina puede lograr una mejor inhibición de MMP. El criterio de valoración principal en nuestro estudio fue la formación de una hemorragia en el cerebro. Análisis de la imagen de las hemorragias macroscópicas mostró un aumento de 2 veces en los animales t-PAtreated en comparación con los animales no tratados. El tratamiento con minociclina intravenosa resultó beneficiosa. A falta de una reducción significativa en el edema puede haber sido debido a la falta de sensibilidad del método utilizado. A pesar de ello, el aumento de la mortalidad entre los animales t-PAtreated parecía ser mejorado con minociclina. Nuestros resultados también mostraron que la minociclina se redujo el tamaño del infarto, incluso después de corregido para el edema, y ​​la mejora de resultado global como se muestra por los ensayos de comportamiento. Se podría argumentar que la disminución de la mortalidad y un mejor resultado comportamiento en el grupo de terapia combinada derivada de la capacidad minocyclines para disminuir el volumen de la lesión en lugar de su protección directa de la vasculatura. 18,24 Sin embargo, porque la formación de la hemorragia se ha demostrado que estar directamente relacionado con aumento de la mortalidad y debido a la minociclina ha impedido la degradación de la lámina basal, es probable que la inhibición de MMP y la protección vascular por minociclina contribuyeron al menos parcialmente, a la reducción de la mortalidad y la protección general después de aguda accidente cerebrovascular isquémico. La minociclina parece un complemento lógico de la terapia de reperfusión con t-PA en el accidente cerebrovascular isquémico agudo. Aunque es conocido como un inhibidor de proteasas, la minociclina en un amplio intervalo de concentraciones clínicamente relevantes no afecta negativamente a la capacidad de t-PA para lisar coágulos in vitro. Además, minocyclines efectos pleiotrópicos en el cerebro incluyen la protección estructural de la vasculatura para evitar leakiness y hemorrágico transformación. Debido a t-PA tiene el potencial para ejercer múltiples acciones negativas en el cerebro vasculatureeither directamente, o indirectamente a través de MMPs o productos de degradación de fibrina terapia 25 combinación es probable que al menos ser aditivos en beneficio. Agradecimientos fuentes de financiación Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (RO1NS044216-01 a SCF), VA Merit Review (SCF), Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (RO1NS055728-01 a DCH y SCF), Asociación Americana del corazón (SDG-0830309N a AIS), y la Asociación Americana del corazón SDG (a ABE). activador del plasminógeno tisular fue un regalo para el laboratorio del Dr. Fagan. Recibido el 1 de mayo de 2009. Aceptado el 4 de junio de 2009. Referencias activador del plasminógeno tisular para el accidente cerebrovascular isquémico agudo. El Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares rt-PA Stroke Study Group. N Engl J Med. 1995 333. 1581 1587. 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